人外周血单核细胞来源树突状细胞(MoDC)的制备作者：Peprotech
背景 DC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC,而其它种类的APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞，因此DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。 DC培养原理 因为DC需从其它种类细胞诱导分化而来，且可分为不同的成熟阶段，所以通常分为2个步骤进行培养: Step 1:从DC的祖细胞(如单核细胞)诱导分化为未成熟DC(immature DC,iDC); Step 2:从iDC诱导分化为成熟DC(mature DC, mDC)。 Step 1: GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子) GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞集落的形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF是最早被鉴定出对DC培养有作用的细胞因子之一。 GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHCⅡ类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF也有助于DC的存活。 IL-4(白细胞介素-4) IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中可抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。 GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC,此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHCⅠ类、Ⅱ类分子和B7家族分子(CD80,CD86等)，但不表达或低表达CD14。 Step 2: TNF-α/IL-1β/IL-6(肿瘤坏死因子-α/白细胞介素-1β/白细胞介素-6) TNF-α,IL-1β和IL-6均为促炎症因子，在感染局部和肿瘤部位被诱导产生。体外研究表明，这3种细胞因子均可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHCⅡ类分子区室(class Ⅱ compartment)消失，但能够上调细胞表面MHCⅠ类、Ⅱ类分子和B7家族分子(CD80,CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC,此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强地激活T细胞。 TNF-α/IL-1β/IL-6三因子组合可在无牛血清培养条件下诱导DC的完全成熟，从而制备出可以应用于临床的DC. PGE2(prostaglandin E2，前列腺素E2) PGE2也是炎性介质，可由TNF-α,IL-1和LPS(脂多糖)等炎症信号诱导产生。 在TNF-α/IL-1β/IL-6成熟诱导组合中添加PGE2,可进一步提高DC的产量、成熟度、迁移能力和免疫激活能力。 这里尤为重要的是DC迁移能力的提高。因为TNF-α/IL-1β/IL-6诱导成熟的DC迁移能力较弱，不能很好地到达淋巴结而激活T细胞。而添加PGE2后诱导成熟的DC因表面趋化因子受体的高表达，更容易迁移至淋巴结，从而引起机体对抗肿瘤的免疫反应。 因此，TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE2组合广泛应用于临床，并被认为是制备成熟DC的“金标准”。 组份工作浓度：TNF-α——10ng/ml； IL-1β——10ng/ml；IL-6——1000U/ml； PGE2——1μg/ml 注意事项 1.DC的来源： DC有多种来源，包括外周血单核细胞(Monocyte)、脐带血CD34+细胞、骨髓和胎肝等，但因外周血单核细胞最容易获取、数量也最多，所以临床上被广泛用作DC的来源细胞。 2.DC的成熟度： 我们知道，DC有未成熟和成熟两种状态，即iDC和mDC，DC的抗原递呈能力与其成熟状态密切相关。 iDC的抗原摄取和加工能力较强，但抗原递呈能力很弱。在体外培养时，iDC去除细胞因子(即GM-CSF和IL-4)后，会逆转为巨噬细胞。且即使在细胞因子的维持下，未成熟DC的功能也不是激活T细胞，而是抑制T细胞的增殖。 mDC则正好相反，其抗原摄取和加工能力很弱，但具有很强的抗原递呈能力。因而可以激活T细胞，引起免疫反应。而且DC成熟后即使在培养体系中去除细胞因子，仍能保持DC的状态和功能，不会发生逆转。 因此可以看出，DC必须完全成熟后才能用于免疫治疗。 3.DC的无牛血清培养: DC最初都是在含有小牛血清(Fetal Calf Serum，FCS)的培养体系中获得的，但我们知道，如果想将DC应用于临床治疗，则不能使用FCS。然而如果不用FCS，DC则无法培养成功。 科学家最先想到的是用10%的人自体血浆来替代10%的FCS，但实验结果表明，人单核细胞在含10%人自体血浆的培养液中培养，用GM-CSF和IL-4诱导7天后，大多数单核细胞仍贴壁，半悬浮的iDC数量非常少。后来经过不断摸索发现，在无血清培养基中添加1%人自体血清对于从单核细胞诱导成为iDC效果最好。 更为困难的步骤是如何在无牛血清培养体系中将iDC诱导成为mDC。 TNF-α和IL-1β在含牛血清培养体系中均是很好的DC成熟诱导剂，而在无牛血清培养体系中，两者均无效或效果微弱。即在无牛血清培养体系中，TNF-α和IL-1β不能将iDC诱导成为mDC，或仅能诱导一小部分iDC成为mDC。 后来的研究表明，用单核细胞条件培养基(Monocyte-conditioned medium, MCM),即单核细胞在包被有免疫球蛋白的细菌平皿上无牛血清培养24小时后得到的培养上清，可在无牛血清培养体系中诱导DC的完全成熟。因此认为，1%人自体血浆+MCM可能成为临床上获得成熟DC的标准方法。 但每次制备的MCM的一致性很难保证，导致每批MCM必须经过测试后才能确定最适用量，这给临床应用带来阻力和不稳定性。所以，人们一直想寻找到能够替代MCM的化学成分明确的成熟诱导组合。 1997年，德国美因茨大学(Mainz University)的Jonuleit等取得了突破性进展，他们发现TNF-α，IL-1β和IL-6三种细胞因子的组合可完全替代MCM,在无牛血清培养体系中能够将iDC诱导成完全成熟的DC.
4.PGE2与DC: 德国美因茨大学的Jonuleit在证明TNF-α，IL-1β和IL-6三种促炎症因子的组合可完全替代MCM,在无牛血清培养体系中能够将iDC完全诱导成熟的同时，也发现另一种炎症介质，即PGE2可进一步提高DC的产量、成熟度、迁移能力和免疫激活能力。也就是说在TNF-α，IL-1β和IL-6之外添加PGE2可获得更为成熟和高效的DC,这样会提高临床上DC的治疗效果。 PGE2常被加入DC成熟诱导组合中最重要的原因是其可提高成熟DC的迁移能力，这样可使DC更容易到达淋巴结，从而引起免疫反应、治疗肿瘤但我们也应该注意以下几点: 1)PGE2不能添加到DC诱导分化的Step 1中，如加入，DC的分化将会被抑制。 2)我们知道，能诱导机体产生Th1反应的DC(很多文献中称为DC1)有助于多种肿瘤，如黑色瘤和恶性胶质瘤等的治疗。 实验研究表明，在成熟诱导因子(TNF-α/IL-1β)中加入PGE2倾向于将iDC诱导成为成熟的DC2，而非DCI，该DC会诱导产生Th2反应。所以很多人试图寻找能够诱导DC1的最佳成熟诱导组合，如TNF-α/IL-1β/IFN-α/IFN-γ/poly-Ⅰ:C，TNF-α/IL-1β/IFN-γ/PGE2(低浓度)/R848(TLR7/8激动剂)和IFN-γ/LPS序贯组合等，但这些新组合都未得到临床上的充分验证，也就没有真正用于临床级别DC的制备。 3)其实，各家的研究结果不尽相同。比如，TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE2组合的创立者--德国美因茨大学的Jonuleit在研究时就发现，添加PGE2诱导成熟的DC在刺激T细胞时可显著提高其分泌的IFN-γ产量，而对IL-4和IL-10的分泌无影响，提示添加PGE2诱导成熟的DC具有诱导Thl反应的倾向。
总之，培养体系中是否加入小牛血清，以及所使用的无血清培养基种类不同等诸多因素都可能导致添加PGE2诱导成熟的DC在性质上的差异，因此临床上制备DC时最好能够做充分的前期研究，然后确定用于治疗某种肿瘤最好的制备方法。 MoDC的制备 1.外周血单个核细胞的采集 1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80-100ml; 1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进-步纯化单个核细胞(PBMC)。 1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC,细胞数量需达到1-3×108。 2.(可选步骤)肿瘤抗原的制备 用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens,TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens，TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。 用TSA或TAA负载的DC具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全细胞抗原负载DC可克服这些缺陷，因为此时无需知道哪些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。 肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC,用肿瘤活细胞负载DC,和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC,因该方法简单、快速、有效。 反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下: 2.1 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净； 2.2 无菌生理盐水洗3次； 2.3 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨； 2.4 200目无菌网过滤后收集单细胞悬液； 2.5 用RPMI 1640养基重悬细胞至1-2x107/ml,装入5ml无菌冻存管中； 2.6 将冻存管浸入液氮中速冻，10min后取出，再迅速放入37℃水浴中解冻10min。反复3-5次； 注:也可以-80℃/37℃反复冻触3-5次。 2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min； 2.8 收集上清，0.22um滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体； 2.9 -80℃保存备用。 3.DC细胞的培养及鉴定 3.1 步骤1中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至2x106/ml，置于培养瓶内； 3.2 37℃，5%CO2培养箱中孵育2h,以使单核细胞贴壁； 3.3 洗去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入含重组人GM-CSF(500-1000U/ml) 和重组人IL-4(500U/ml)的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化； 3.4 每2-3d半量换液一次，并补足细胞因子； 3.5 (可选步骤）在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50ug/ml, 对DC进行抗原负载；注:若不对DC进行抗原负载，该步省略。 3.6 在培养的第6d,加入重组人TNF-α(10ng/ml), IL-1β10ng/ml), IL-6（1000U/ml)和PGE2(1μg/ml)，诱导DC细胞成熟； 3.7 在培养的第7d或第8d，收获DC细胞，其数量应达到1×106个以上； 3.8 DC的质检: 3.8.1 活细胞比例:台盼蓝染色验证活细胞应在90%以上； 3.8.2 形态学观察:>90%细胞半悬浮，细胞有多个树突样突起； 3.8.3 流式细胞术检测DC细胞表面CD14、HLA-DR、CD40、CD80、CD83和CD86等分子的表达，成熟的DC不表达CD14，而高表达其他分子。CD83是成熟DC的特异性标志，在单核细胞和不成熟DC表面不表达或低表达； 3.8.4 无菌检测:收获细胞前取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，均应为阴性； 3.8.5 内毒素检测:回输前，用鲎试剂检测内毒素含量，标准:内毒素<0.5EU/ml。 参考文献 [1]Steinman RM,Cohn ZA.Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid [2]Bender A,Sapp M,et.al.Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood. J Immunol Methods.1996；196(2):121-35. [3]Romani N,Reider D,et.al.Generation of mature dendritic cells from human blood.An improved method with special regard to clinical applicability,J Immunol Methods. [4]Jonuleit H,Kühn U,et al.Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce [5]Datta J,Terhune JH,et al.Optimizing dendrtic cell-based approaches for cancer [6]de Jong EC, Vieira PL,ea al.Microbial compounds seletively induce Thl cell-promoting or Th2 cell-promoting dendritic cells in vitro with diverse th cell-polarizing signals.J Immunol. 2002 Feb 15；168(4):1704-9. [7]张志伟，宋鑫。DC-CIK细胞临床制备规范化研究。中国肿瘤，2011；20(2):85-88。
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