如何分离小鼠脾脏获得单细胞悬液

工具/原料

活体小鼠(6-8周龄正常小鼠)

小鼠解剖器具

PBS溶液或HBSS加2%FBS

推荐培养基:EasySep buffer(20144)或PBS加2%FBS加1mM的EDTA

细胞筛(70um)

培养皿、注射器

细胞培养瓶、离心管

常用移液管及移液枪


方法/步骤1:

颈椎脱臼法处死小鼠,75%乙醇浸泡5分钟,取出小鼠置于无菌操作台上,左腹侧朝上。解剖小鼠腹部,扒开内脏,可看到如图所示的长约3-4厘米呈长条状的深红色组织,即为脾脏;

方法/步骤2:

将脾脏组织转移到 35 mm 无菌培养皿(产品号 #27100/27150)中。后续如需进行细胞分选,在培养皿中加入 5 mL 推荐培养基(请参阅试剂盒产品说明书)。如解离组织后不需细胞分选,请在培养皿中加入含 1 mM EDTA 的 PBS。 注意:如同时处理多个脾脏样本,需使用 100 mm 培养皿(产品号 #27125/27127),并加入 10 mL 培养基;


方法/步骤3:

去除脾脏组织上的结缔组织或脂肪,注意坏死区域,并检查脾脏是否有肿大、变色或病变。记录起始样本的状态对于后期评估细胞非常重要;


方法/步骤4:

从 3 cc 无菌注射器(产品号 #28230/28240)中取出活塞/柱塞。使用扁平的末端部分以温和画圆的方式研磨脾脏 5 次。这样可以破坏脾脏和髓质,释放脾细胞;


方法/步骤5:

将一个 70 μm 细胞过滤器(产品号 #27216/27260)置于 50 mL 无菌锥形管上,并用 2 mL 推荐培养基润洗滤网。 注意:细胞可能会黏附于干燥的滤网上,润洗滤网可以减少这种情况;

方法/步骤6:

使用润洗过的 5 mL 或 10 mL 移液管将脾细胞吹打均匀;


方法/步骤7:

将上清液和组织从培养皿转移至润洗过的 70μm 细胞过滤器(产品号 #27216/27260)。使用一个新的 3 cc 无菌注射器的活塞/柱塞,以温和画圆的方式使细胞和组织通过滤网。用 3 mL 推荐培养基冲洗滤网;


方法/步骤8:

离心 300 x g,10 分钟来收集细胞。弃去上清, 轻轻敲击试管重悬细胞。如有需要,可在试管中加入 40 mL 推荐培养基,进行第二次洗涤。重复这个步骤


方法/步骤9:

脾细胞可用于下游应用。使用stemcell磁珠分选试剂盒,无需去除红细胞!有核细胞计数。