biotechne产品使用常见技术问题解答- Cell culture 细胞培养相关

4.1 BME 基质胶

BME储存条件及建议稀释浓度 建议-80°C储存，使用前分装，4°C 过夜，避免反复冻融。建议用培养基稀释至10mg/ml。

BME工作原理 BME 基质胶由哺乳动物肉瘤纯化得到，BME是由可溶性基底膜蛋白组成，在37℃下凝胶化，形成可重构的基底膜。主要成分包括 层粘连蛋白I、胶原蛋白IV、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖。BME可用于促进和维持多种细胞类型的分化表型。该基质也可作为评估 迁移细胞侵袭潜能的屏障。

BME如何促进细胞分化 所有的上皮细胞和内皮细胞在至少一个表面上都与基底膜基质接触。通过细胞外基质，细胞可以呈现更生理的形态(即正确的形 状)，并开始表达细胞谱系特异性蛋白。而二维的塑料表面，加上含血清的培养基，会导致细胞变平、增殖和分化。

如何选择合适的基质胶（BME）？各个型号之间的区别是哪些？ Cultrex®Basement Membrane Extracts (BME)基质胶是一种由小鼠细胞的胞外蛋白质组成的胶，因为其可以模拟体内细胞基底膜 的结构、组成，从而让细胞在培养皿中生长不再局限于平面。产品分类是依据不同的应用在结构上进行优化，在主要成分巢蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白IV和基底膜蛋白多糖之间的成分配比不同，导致各种胶的拉伸力和孔径大小不同，从而适应不同实验 的需求，不是单纯浓度的区别。 Cultrex®Stem Cell Qualified Basement Membrane Extract (BME)提供了一个无滋养层细胞的表面来帮助胚胎干细胞和诱导多 能干细胞进行在非分化的环境下进行粘附和维持，用于促进细胞生长或研究干细胞的分化。 Cultrex® BME Type 1 通用型，适用于所有2D、3D培养。 Cultrex® BME Type R1 有专利配方的优化后的特殊结构，此种胶中用于连接层粘连蛋白和胶原蛋白从而可以加强水凝胶的结构 的巢蛋白含量更高，所以此种胶较之通用型、Type2、Type3有最好的拉伸力。合适对特别难生长的类器官（Difficult to culture organoids）进行培养。 Cultrex® BME Type 2 有专利的优化后的特殊结构，相较之通用型有更高的拉伸力，因此适合生长旺盛型的类器官（Robust organoid）。适用包埋法培养。 Cultrex® BME Type 3 在生理学上与体内肿瘤生长的环境最为类似，被推荐用于异种/肿瘤移植（Xenograft/Tumorgraft）或模拟其他类似应用。模拟体内微环境（低葡萄糖、低PH），促进异种、肿瘤移植细胞的得率和生长。 Cultrex® BME 3-D Culture MatrixTM BME 该型胶的标准浓度在15 mg/ml，特殊的专利结构为3D培养而优化。

细胞侵袭用的基质胶产品推荐？ 我司细胞侵袭检测试剂盒主要有：

我们的试剂盒验证了NIH-3T3，HT1080，MCF-7，和MDA-MB-231四种不同来源的细胞系，客户可以通过查阅文献或者参考我们 说明书上的实验数据选择合适的基质胶进行实验，可以根据侵袭能力选择不同密度的BME。

345系列和348系列产品组成不同，前者只有基质胶，需要客户自己包被；后者是预包被好的板子，因此会有不同的浓度供选择。 在侵袭实验中，基质胶的浓度对不同侵袭能力细胞的侵袭实验是有影响的。345系列除了3455-096-k是BME混合成分的，其他都 是单一成分的。客户可以根据不同的研究目的选择，如关注侵袭能力和Laminin相关性时，可以选用3456-096-k。通常情况，建议推荐的3455-096-K（BME混合成分的），客户需要根据细胞特性稀释到相应的浓度。

非肿瘤源性的BME掺入的细胞如果移植在体内的话如何增殖分化 与Cultrex®BME混合并植入体内的非转化细胞已被发现可以继续存活并保持分化，但一般不会生长。未发现正常组织在这种情况 下发生转化。例如，Sertoli细胞至少能存活一周，并保留其绳状结构。

4.2 3D培养

3D培养定义 3D培养是指在体外培养中，将永生化细胞系、原代细胞系、干细胞或外植体置于模拟体内细胞环境的水凝胶基质中，并允许细胞 在三维空间中增殖。

三维（3D）与二维（2D）培养的区别 二维培养的细胞与它们的组织相比，在形态、功能、增殖和基因表达方面都发生了改变。通过将这些细胞置于三维环境中，它们 呈现出与在体内观察到的类似的生物和生化特征。

BME和3D培养基的区别 3D培养基质提供标准化的BME，针对3D培养。采用一种特殊的工艺来降低生长因子并以标准浓度提供材料。然后将该材料加入 3D培养中以验证其有效性。

3D培养的前期工作 细胞需要在二维培养中保持健康并积极分裂。细胞从低温保存中复苏后，应传代2-3次，每次传代的融合率不得超过80%。细胞也 应使用台盼蓝进行评估，其染色率应低于5%。

影响3D培养的变量 与三维培养相关的主要变量是细胞类型、细胞播种密度、水凝胶组成、水凝胶厚度、水凝胶硬度、细胞培养基组成和培养时间。

3D培养类型 Top assay：细胞接种在厚的凝胶上，然后在细胞培养基上覆盖一层薄层。 Embedded assay：细胞被重悬在一个厚的凝胶中，然后在上面施加培养基。 Top assay更容易设置，控制种子密度，并将细胞保持在一个焦平面内进行分析。

3D培养基质选择 基质的选择应符合你希望模拟的环境。Cultrex®基底膜提取物（BME）主要作用于基底膜，它是大多数上皮细胞或内皮细胞的基 础。Cultrex® I型胶原（Collagen I）是结缔组织的主要成分，常为纤维细胞、脂肪细胞等固定细胞和肥大细胞、巨噬细胞、单核 细胞、淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞等迁移细胞所占据。

3D培养的常见分析指标 形态，极性，蛋白定位及表达，增殖，DNA，RNA。

3D培养增殖分析试剂盒 我们提供了Cultrex® 3-D Culture Cell Proliferation Reagent Cultrex® 3D Spheroid Colorimetric Proliferation/Viability Assay（3511-096-K） Cultrex® 3D Spheroid Fluorometric Proliferation/Viability Assay（3510-096-K） 3D培养增殖分析试剂盒原理为MTT，3511-096-K 为比色法，3510-096-K为荧光法。

3D培养收集细胞试剂盒 我们提供了Cultrex® 3-D Culture Cell Harvesting Kit专供细胞收集（3448-020-K）。

Laminin I 及其工作浓度 层粘连蛋白I是细胞外基质的主要成分。Cultrex®层粘连蛋白I是从小鼠EHS肉瘤中纯化得到的。它由α1β1γ1链组成，分子量约800kDa。Cultrex®层粘连蛋白I增加细胞粘附、迁移、生长、分化、神经突生长、蛋白酶生成和恶性肿瘤。响应取决于细胞类型。 根据细胞类型在培养板中0.05-10 µg/cm2或者0.05 - 10 µg/ml的薄涂层。3D培养的浓度为6mg/ml 。

Mouse Laminin I 可否用于细胞爬片 Mouse Laminin I可用于细胞爬片，已经有多篇相关文献发表。

Cultrex™ Collagen I (Rat) 与 3-D Collagen I Rat Tail 的区别 Cultrex® Collagen I (Rat) 和3-D Collagen I Rat Tail两种产品用的是同样的原料、纯化方法及有效性测试。 3-D Collagen I Rat Tail还附加了3D培养的验证，包括细胞的增殖、分化、3D可见的形态变化。

血小板凝集（platelet agglutination）实验推荐何种基质产品？ 常规的Collagen I 或者3-D Collagen I 基质都可以用于血小板凝集实验。不过根据文献报道，我们发现collagen type VI（货号 3410-010）更适合此类实验，具体的文献可以参考：http://www.jbc.org/cgi/content/full/270/18/10822

Cultrex® Collagen I 与 Cultrex® Rat Collagen I (LV) 的区别 Cultrex® Rat Collagen I 为5 mg/ml 浓度，不酶解。Cultrex® Rat Collagen I (LV) 低黏度3mg/mL 浓度，酶解。需冰醋酸溶液中和。

管生成（Tube Formation）实验及其优势 管生成实验是基于内皮细胞在使用BME水凝胶培养形成3D管腔结构的能力的一种实验方法。 它可以用来识别潜在的血管生成和抗血管生成因：确定内皮细胞表型，研究血管生成的途径和机制。它可以在高通量模式下进 行，以筛选大量的化合物。因此，造管实验是目前应用最广泛的体外血管生成实验。

适用于管生成实验的细胞 内皮细胞（原代或永生化的细胞系），只有内皮细胞适合此类实验。

影响管生成实验的变量 BME水凝胶的组成、BME水凝胶厚薄程度、接种细胞的密度、刺激细胞的细胞因子。

适合管生成实验的BME Reduced Growth Factor BME (RGF BME) ，它含血管生成因子非常少，所以一般用作管生成实验的BME。也可用Trevigen®品牌 (已并入R&D sysytems)相应的管生成试剂盒：Cultrex® In Vitro Angiogenesis Assay Tube Formation Kit（3470-096-K）来完成实验。

如何减少管生成？ 在缺乏血管生成因子的情况下，原代内皮细胞（比如原代血管内皮细胞）会比永生化的内皮细胞更难形成毛细管腔结构。确定细 胞数量，找到最适合你的特定细胞系的条件。当内皮细胞在血管生成激活物的作用下形成完全形成的毛细血管结构，而不是在没 有血管生成激活物的情况下，可以继续进行实验。一般来说，减少BME细胞每平方厘米的细胞数会导致更少的背景或自发成管。

4.3 Cell Functional Assay细胞功能实验

Cell Migration (细胞迁移)的概念 在趋化因子刺激下，细胞顺趋化因子浓度梯度移动。Cultrex®细胞迁移试验根据细胞在趋化梯度作用下通过8微米孔隙的无涂层膜 的能力来评估细胞迁移。细胞必须经历细胞骨架重塑，以适应微孔直径，并把自己拉到膜的底部。

Cell Invasion (细胞侵袭)及其影响因素 细胞侵袭是细胞迁移并突破物理屏障（细胞外基质）。 主要影响因素细胞类型、细胞密度、细胞外基质组成、厚度、趋化因子、培养时间。

细胞侵袭用的基质胶推荐 基底膜提取物(BME)可以重建基底膜，基底膜是大多数上皮细胞或内皮细胞来源的基础。I型胶原是结缔组织的主要成分，常为纤 维细胞、脂肪细胞等固定细胞和肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞等迁移细胞所占据。

Cultrex™ Cell Invasion Assay（细胞侵袭实验）适用的细胞 侵袭性的具有黏附功能的细胞系。如果你的细胞系是具有黏附功能，并且有文献支持其具有侵袭性，它就适用。如果没有文献支 持，但细胞有潜在侵袭性，可先做预实验证明。一般来说，细胞如果不能在趋化因子的刺激下迁移，就没有侵袭性。

细胞侵袭实验与划痕实验（wound healing assays）的区别划痕实验（wound healing assays）：是单层细胞迁移实验，通过转移细胞、预先处理培养皿使细胞无法生长，人为制造一个在 单层细胞中的空间，测量单层细胞覆盖此空间的能力。该实验受细胞外基质蛋白的影响。 由于该实验是在一个腔室中进行，所以，与细胞侵袭实验（Cell Invasion Assay）相比，它没有趋化梯度，没有膜，细胞不再需要 改变形状和挤压通过孔隙。另一个潜在的问题是，这种方法不能控制细胞增殖的差异。

钙黄绿素标记的侵袭细胞能不能在培养？ Calcein AM细胞毒性应根据经验确定每个细胞系或模型。为了获得最好的结果，应尽快将细胞从细胞分离液中取出并置于新鲜培养基中。

自由基刺激下如何获得更多的定量数据？ 8-OHdG：自由基刺激下的DNA损伤Maker，此外Trevigen   (已并入R&D sysytems®) 还提供了HT 8-oxo-dG ELISA kit II 供检测。

哪些试剂盒可以用于氧自由基检测 超氧化物歧化酶测定试剂盒（Superoxide Dismutase Assays）货号为7501-500-K，7500-100-K适用于氧自由基检测。

4.4 Cell Culture细胞培养基及辅助成分

为什么细胞培养基里要放丙酮酸钠 丙酮酸钠是许多低葡萄糖和高葡萄糖DMEM培养基配方中的添加剂。丙酮酸钠可以被细胞用作能量生产和其他关键代谢途径的碳 源，而不必通过生物合成的葡萄糖或氨基酸来生产。一些细胞系需要向培养基中添加丙酮酸，因为它们缺乏将葡萄糖或氨基酸转 化为丙酮酸的能力。

GlutaminePlus 和 L-谷氨酰胺的区别 GlutaminePlus是L-谷氨酰胺的衍生物，通过L-丙氨酸和L-谷氨酰胺的化学反应得到，以液体形式或作为现成的ATLANTA制品品牌 细胞培养基(含有稳定的L-谷氨酰胺的培养基)的成分。GlutaminePlus在细胞内代谢产生L-谷氨酰胺+第二氨基酸。使L-谷氨酰胺稳 定地产生，避免氨积聚。这一特性对氨敏感细胞系尤其重要。谷氨酰胺是一种重要的氨基酸，对细胞的生长和功能起着重要作 用。虽然L-谷氨酰胺在结晶状态下是稳定的，但在短时间内它在溶液中有非酶降解和不可逆降解的倾向。这种L-谷氨酰胺的分解速 率取决于pH值、温度和各种阴离子的存在。其中一个副产品-氨，可能会导致细胞毒性或生长抑制。由于其化学稳定性和对细胞 生长的重要意义L-谷氨酰胺的递送必须优化到每个特定的细胞培养应用中。在细胞培养基中使用稳定的L-谷氨酰胺衍生物是实现L谷氨酰胺在细胞中可靠传递的一种推荐方法。

R-spondin1 是什么来源的？ R-spondin1 的特异性？ 哺乳动物的R-spondin1该蛋白具有保守性，常用于人体类器官培养。来自该细胞系的条件培养基已被世界各地的许多实验室广泛 用于类人器官的培养。

培养基内R-spondin1 的鉴定 R-spondin1 的分子量为70-75 KDa，可以用WB鉴定。

有什么Functional assay（功能性实验）能够检测条件培养基? 可以使用TopFlash assay. 将HA-R-Spondin1-Fc条件培养基与已知活性的R-spondin1源进行比较，根据所需的最终浓度，决定条 件培养基的浓缩或稀释程度。

4.5 Stem Cell 干细胞培养与定向分化

N-2 MAX Media有没有钙盐、杆状病毒、动物源性蛋白 N-2 MAX Media没有添加钙盐和动物源性蛋白，该试剂经检测，无杆状病毒。

小鼠皮层干细胞（Cortical stem cell）在失去其多能性之前可以传代多少次 如果用普通的贴壁培养，可传代三次，如果用神经球系统培养，可传代七次。

用StemXVivo® Cardiomyocyte Differentiation Kit 几天看心肌细胞分化 使用试剂盒10-13天可观察到心肌肌胞的收缩。

人间充质干细胞功能验证试剂盒中的成分是否可替代？ Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit中的90415，390416，390417 和CCM011，CCM008，CCM006 成分相同，是经过我们优化的最佳配方。

CCM021有结晶正常吗？ CCM021的结晶是钙盐在低温下形成的，属正常现象，少量结晶不影响产品性能。

甲基纤维素培养基有EPO和没有EPO有何区别？ 促红细胞生成素(EPO)是一种有效的细胞因子，可促进造血干细胞的分化。红细胞的发育需要EPO。没有促红细胞生成素的培养基为研究人员提供了扩展和区分造血干细胞的能力，然后测试辅助药物或感兴趣的化合物。

Methylcellulose Stock 和 Base Media的区别 Stock包含在Iscove改良的Dulbecco培养基中的甲基纤维素。Base Media包含Iscove改良的Dulbecco培养基中的甲基纤维素，以 及血清、白蛋白、L-谷氨酰胺和2-巯基乙醇。需要Base Media的附加试剂来维持HSCs的生存能力和生长。使用HSC002的优势在 于，研发系统已经对血清、白蛋白、L-谷氨酰胺和2-巯基乙醇进行了内部评估，以确保批次之间的一致性，而无需研究人员对这 些成分进行单独评估。

N-2 Plus Media Supplement 和N-2 MAX Media Supplement 的区别 N-2 Plus Media Supplement用牛胰岛素，N-2 MAX Media Supplement 用人胰岛素。

分化后的神经祖细胞培养要不要加BME建议加BME，可用Cultrex® RGF BME处理，也Cultrex® Poly-L-Lysine (Catalog # 3438-200-01; 10 µg/mL)铺板，再加 Cultrex® Laminin (Catalog # 3400-010-02; 20 µg/mL)代替。

神经祖细胞可以传几代 一般可以传5代，但最好在分离后7-8天进行分化实验。