biotechne产品使用常见技术问题解答-多因子

3.3 Luminex® Assay多因子分析

R&D Systems® Luminex® Assay与 High Performance Assay的区别总的来说，Luminex® Assays和Luminex® High Performance Assays的灵敏度是相似的。Luminex® High Performance Assays由精选的分析物组成不同的panel，这些panel经过了严格的测试和验证。 Luminex Assay有三百多种因子可供选择，可以让研究者组合出自己独有的panel，是最具有灵活性的产品。适用于大样品的初筛。 High Performance Assays中提供的稀释剂已经过优化，使在同一panel上的分析物均能得到最佳结果。High Performance Assays 是R&D Systems®提供的最精确、重现性最好、准确度最高的Luminex®检测试剂盒。Human Luminex® High Performance Assays 能够提供质控品，同时它也是市场上最好的多因子液相芯片产品，能够与同指标Quantikine® ELISA结果相比较。

是否有Luminex试剂盒操作演示视频？ 您好，我司官方微信公众号RnDSystems（互动达人-操作视频）及Bilibili（UID:509961500）上均有相关的视频。

客户一个Luminex试剂盒做80个样本为何稀释液不够？ 每个Luminex试剂盒包含1个96孔板。Luminex试剂盒开发时，为了实验的严谨，我们默认每个标准曲线点及样本为复孔上样，所以一个试剂盒的稀释液足够支持40个样本。若需要稀释80个样本，客户在样品配制时需要进行相应的调整，避免不必要的样品及稀释液浪费，比如当样本需要1：1进行稀释时，可以30ul样品与30ul稀释液混匀，而不用50ul样品与50ul稀释液混匀。但是一般情况下，为了减少误差提高实验的准确性，我们建议客户做复孔。

如何定制Luminex Assays以及我如何知道不同分析物间能否兼容? 您可以使用我司的Luminex®定制系统Luminex® Assay Customization Tool (https://www.rndsystems.com/cn/luminex/analytes) 进行在线定制时，若您选择的分析物放置在一起可能出现不兼容情况，则不会生成在同一个试剂盒中。若分析物组合针对特定样本存在不兼容情况，则会出现黄色提示框，若有不清楚的可以联系我们的销售及技术进行咨询。

Luminex 提供的板子及试剂是否是一次性的？ Luminex®一次实验可以不用掉整块板。如果只使用部分孔，我们建议在实验时覆盖未使用的部分，因为此板井不是可拆卸的条状，所以需要覆盖以避免污染。并且已使用的孔不建议重复使用以避免交叉污染。

R&D Systems® Luminex系列产品质控（QC）内容包括哪些? Luminex High Performance系列是目前市场上Luminex 最准确试剂盒。Luminex Assay系列达到同行业标准。 QC一般测回收率、线性稀释度、天然蛋白检测准确度、检测特异性，整体试剂盒检测准确度等。通常High Performance系列产品的说明书中会有各指标的QC数据，常规Luminex Assay不提供具体指标的QC数据。

Luminex ® High Performance Assay不同panel中的分析物能否一起使用? Luminex® Performance Assay的每个panel均针对panel内的分析物组合进行了缓冲液和试剂的优化，会存在同一个分析物在不同 panel中出现的可能，不过需要注意的是，不同Panel中分析物的标准曲线范围，对应样本及稀释建议可能不同。因此，不同的 Luminex® Performance Assay中的分析物不能组合使用。 Base kit只包含针对特定panel中分析物的标准曲线及缓冲液，与其他panel中的分析物不兼容。

R&D Systems® Luminex 试剂盒一般测的是可溶性蛋白吗？ 是的，因为检测的样本类型(血清、血浆及细胞上清液)一般含有可溶性蛋白，对于组织或者细胞裂解液样本，我们的抗体也有可能识别其中的膜蛋白，但是这方面我们没有测试过。

R&D Systems® Luminex检测与ELISA检测，样本的处理是否有区别？ 两类试剂盒检测样本的处理方法大致相同，具体的样本处理方法在说明书中有详细描述。Luminex验证过的样本类型有限，主要是细胞上清液，血清及血浆，而不同ELISA试剂盒可能验证过更多的样本类型（尿液，乳液，唾液等），在针对未经验证的样本建议客户进行掺入回收及线性稀释实验验证系统的准确性。

Luminex实验出现珠子（beads）数量低于50，可能的原因和解决方式？ 珠子（beads）数低的可能原因有： 1.样品粘稠，未有效稀释。解决方法：测定前，将血浆样品解冻，16,000 xg离心4分钟,或更长。用校准稀释液（Calibrator diluent）进行建议的稀释。 2.收集时微球未悬浮读板前立即震荡微球溶液1min以重悬微球。 3.微球聚集或成团解决方法：将微球混合浓缩液进行1000 x g离心30s，制备1X微球混合液前进行轻柔涡旋。 4.洗涤时，磁珠未落到微孔板底部确定磁力架正确的结合在微孔板上, 洗板时磁力架应置于微孔板底部，弃去洗涤液前应静置1min。不要吸干，以防止磁珠丢失。 5.仪器未正确校准解决方法：每周进行仪器校准，在实验当天使用验证试剂盒确定仪器功能运行正常。校准及验证见仪器使用说明。 6.微球收集数设定不正确解决方法：设定微球收集数（events/microparticle）为50，保证微球数量收集充分以获得统计学准确结果。 7.针孔堵塞，针孔过高或者过低导致没有完全将beads吸到解决方法：清洗针孔或者调整针的高度至合适位置，清洗过程请参考：https://www.rndsystems.com/cn/resources/faqs/luminex-instrumentation 8.系统超时(针对Luminex® 100/200™ 和FLEXMAP3D™) 解决方法：在使用基于流式细胞术的仪器如Luminex® 100/200™时，如果仪器超时(timed-out)，请停止运行。确定进样针的高度并选择正确的微球类型，重新读板。因为仪器指定收集50个微球，超时可能导致针对某个或多个分析物微球计数不够。MagPix® 仪器针对每个因子的读取时间固定，不会有超时提示功能。

3.4 Proteome Profiler Array固相抗体芯片

固相抗体芯片（Proteome Profiler Array）的原理是什么？ 固相芯片是利用抗原抗体结合原理，在PVDF膜上包被捕获抗体，配合相应的检测抗体，及缓冲液，显色液体系，构建的抗体芯片检测系统。可同时检测样品中15~119种蛋白。结果类似多个Dot Blot，但具有很高的重复性和灵敏度。

固相抗体芯片是否可以定量？ 不可以，固相抗体芯片是用来筛选样本中是否同时表达多项因子，如果使用不同的膜检测相同的样本和部分相同的因子，所测得的点的亮度有可能是不一样的，因为亮度的多少还取决于抗体与靶标因子的亲和力。

参考点（Reference Spots）有什么作用，能否作为内参？ 在膜上的左边上下角各有一对参考点，在膜上的右边上角有一对参考点，可以根据其布局对膜上的点（靶因子）进行定位，避免搞反方向。这些参考点内包被了生物素化的蛋白，会与Streptavidin-HRP反应显色。需要注意的是，参考点内蛋白及其敏感，仅供实验指示用，并不能作为内参使用。

如何检测固相抗体芯片？ 步骤简述： Step1 样本准备：细胞/组织裂解，总蛋白定量 Step2 样本/芯片反应：芯片在封闭液中封闭1小时后，与样本2-8℃过夜孵育。 Step3 与捕获抗体孵育：结合了抗原的芯片，与捕获抗体室温孵育2h。 Step4 加入化学发光试剂反应1分钟 Step5 按照X-光片曝光/凝胶成像/近红外成像的方法，进行芯片的成像和数据分析。详情可以参考我司官方微信公众号RnDSystems （互动达人-操作视频）及Bilibili（UID:509961500）上相关的视频。

如何分析固相抗体芯片的结果？ R&D Systems® 提供了Quick Spots 图像分析软件专用于固相抗体芯片的结果分析（https://www.wvision.com/QuickSpots.html ）。 Quick Spots包含了固相芯片的专用模板，相比其他软件更方便快捷。请注意此软件需要购买，免费试用版只能得到结果不能导出。此外，客户也可以用Quantity One或者Image J 软件，自行建立模板对各孔的灰度值进行分析。