Corning Biocoat-侵袭实验步骤

实验流程：细胞侵袭实验

侵袭实验提供了一个体外的系统来研究恶性和正常细胞的细胞侵袭。具体的应用包括肿瘤细胞转移能力的评估¹、通过细胞外基质成分²或抗肿瘤药物(TAXOL^®)³对新陈代谢的抑制、细胞表面蛋白的异常表达、或转移性细胞中基质金属蛋白酶⁵的异常表达；和正常细胞的侵袭，例如胚胎干细胞⁶、细胞滋养层⁷、内皮细胞⁸和成纤维细胞⁹。侵袭研究已经成功地在各种肿瘤细胞   (细胞系或原发性肿瘤)中进行，包括黑色素瘤、恶性胶质瘤、星型细胞瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤以及肺、前列腺、乳房、卵巢和肾脏的恶性腺瘤。

包被了Corning^® Matrigel^®基质的侵袭小室给细胞提供了允许在体外评估其侵袭能力的条件。康宁基底膜基质在体外充当重组的基底膜，封闭膜的孔并且阻止非侵袭细胞通过膜的迁移。与此相反，侵袭性细胞(恶性的和良性的)分泌酶促降解康宁基底膜基质的蛋白酶并通过膜孔进行侵袭。可以在在光学或电子显微镜下处理膜并且在染色后容易移除。利用在康宁基底膜基质包被的渗透性支持物(8.0 µm孔直径)上培养HT-1080人纤维肉瘤细胞，下列的实验程序已经被优化。根据实验的条件包括细胞¹⁰、培养基、培养时间、细胞接种密度和趋化因子，实验结果可能有变化。因此，对于每个系统，包括细胞培养渗透性支持孔大小的条件应该被优化。

材料：

与平板一起包装的康宁BioCoat^{™细胞培养渗透性支持物(24孔，康宁货号354578)，或者独立包装的支持物(24孔，康宁货号353097)。也可以获得不同孔径大小的Falcon®}细胞培养渗透性支持物

Falcon细胞培养渗透性支持物附平板(24孔，康宁货号353504)

康宁基底膜基质(10 mL小瓶，标准康宁基底膜基质，货号354234；或生长因子减少的康宁基底膜基质，货号354230)

组织培养基中的趋化因子，例如5%小牛血清

以重碳酸盐为基础的培养基，例如DMEM(无血清)

Tris；氯化钠(包被缓冲液)

0.2 µm滤器

迪夫快速染色试剂盒(Allegiance货号B4132-1A)，或其他合适的固定剂和着色剂

含相机(可选)的显微镜

棉签

无菌钳

容积式移液管

注射器

实验程序：

包被程序

注意：下列的步骤必须利用无菌技术执行。Corning^® Matrigel^®基质应该按照产品规格书的要求进行重组、分装和储存。康宁基底膜基质的浓度是批次特异的并且以分析证明书为基础。在实验全过程中，康宁基底膜基质和包被缓冲液必须保持冰冷。

准备包被缓冲液：0.01M Tris (pH 8.0)，0.7% NaCl。滤器使用一个0.2 µm无菌滤器。

将分装的康宁基底膜基质放在冰上4°C 解冻。一旦解冻，涡旋小瓶确保材料均匀分散。请将产品放置在冰上并进行无菌操作。

注意：允许包被缓冲液在冰浴、冷室或冰箱中冷存2个小时。任何将要接触康宁基底膜基质的

移液管、注射器或容器都必须在使用前预冷。如果移液管和注射器是包装在塑料袋内，那么它们可以安全地放置在冰上。

准备康宁包被溶液：混合康宁基底膜基质(终浓度为200-300 µg/mL)和包被缓冲液，使终体积为2.0 mL。通过轻柔的涡旋彻底地混合含有康宁基底膜基质的包被溶液，之后将管子放置在冰上。

注意：包被溶液中的康宁基底膜基质的数量应该足够包被12个24孔独立的渗透性支持物。这一实验需要相应数量的渗透性支持物。对每一个新的注射器，填充一半康宁基底膜基质，排出， 之后完全填充用以包被。如果使用容积式移液管，则需要更大体积的康宁基底膜基质来防止或最小化气泡的形成。

渗透性支持物包被：

在罩子下，移除24孔渗透性支持物板的盖子(康宁货号354578)；或打开独立包装的渗透性支持物(康宁货号353097)，然后使用无菌钳将需要数量的渗透性支持物放入Falcon^® TC配套板(康宁货号353504)的孔中。

使用无菌的注射器或者移液管小心地向每个渗透性支持物中加入0.1 mL稀释的康宁基底膜基质包被溶液。请最小化康宁基底膜基质和渗透性支持物侧壁的接触。余下的渗透性支持物执行相同的包被步骤。

注意：在移液管吸取液体加入到每个渗透性支持物中时，请避免气泡。如果孔中含有气泡，请在4°C 预冷的离心机中将培养板离心300 x g，10分钟。

包被好的渗透性支持物板在37°C 培养2个小时。包被的侵袭小室现在可以使用了。

侵袭程序

利用无菌钳将渗透性支持物转移到Falcon   TC处理的配套板的空孔中，以此准备等量的对照(未包被)渗透性支持物。

为了准备用于侵袭实验的细胞，请根据您的需要(例如，培养基、血清浓度和汇合)培养细胞。对于HT-1080，在进入侵袭小室亚培养之前，我们推荐培养到~70-80%的汇合。

在24孔侵袭小室中，在含有5x10⁴个细胞/mL的培养基中准备细胞悬液。

注意：在多孔膜生长表面为了确定您细胞类型的最优接种密度，请分别使用在非多孔表面(例如，培养瓶、培养皿和培养板)使用的经典接种密度。例如，如果您要使用1x10⁵个细胞/cm²的接种面积，请接种5x10⁴到5x10⁵个细胞/cm²以确定最优的接种面积。

向24孔侵袭小室的每个孔中加入0.5 mL细胞悬液(2.5x10⁴个细胞)。

通过入口向Falcon^® TC配套板的每个孔中加入趋化因子(0.75 mL)。注意：请确保在渗透性支持膜的下方没有气泡。

请在湿润的组织培养箱中过夜培养细胞侵袭小室，37ºC ，5%的CO₂。

细胞侵袭的测量去除非侵袭细胞

将用培养基湿润过的棉签插入Corning® Matrigel®基质渗透性支持物(顶侧)的顶部，当轻柔的摩擦这一区域时请施加轻柔、持续的压力。请使用第二根培养基湿润的棉签重复。

细胞的染色：

注意：膜较低表面的细胞会使用迪夫快速染色进行染色。迪夫快速染色试剂盒含有固定剂和两种染色剂。将渗透性支持物连续转移到3种迪夫快速溶剂并进行2次漂洗后，染色完成。细胞核会染成紫色，细胞质会染成粉红色。

将迪夫快速染色试剂盒中的每种溶液(0.5 mL)加入到Falcon TC配套板的3行中。向两个24孔板中加入蒸馏水(0.5 mL)，或加入到两个烧杯中(150 mL)。

将渗透性支持物连续转移通过每个染色剂和两个含水板(或烧杯)中。在每个溶液中允许停留2分钟。

将渗透性支持物放置在空气中干燥。

注意：或者，细胞可以在100%的甲醇中固定，在1%的甲苯胺蓝中染色(见下面)。或者使用苏木精和伊红染色或者使用结晶紫进行染色。

向Falcon TC配套板适当数量的孔中加入100%的甲醇(0.5 mL)。在另一个单独的板中，向合适数量的孔中加入在1%的四硼酸钠中溶解的1%甲苯胺蓝。向两个24孔板中加入蒸馏水(0.5 mL)， 或加入到两个烧杯中(150 mL)。将渗透性支持物转移进甲醇中2分钟，然后转移到甲苯胺蓝中2 分钟。在盛有蒸馏水的两个24孔板或烧杯中漂洗渗透性支持物来去除多余的染料。将渗透性支持物放置在空气中干燥。

侵袭细胞的计数

注意：通过显微镜，对附着在基部表面的细胞进行图像采集能够促进细胞计数。细胞的直接计数也是可以的。

在大约40X-100X放大的显微镜下观察侵袭的细胞和/或采集侵袭细胞的图像，总的放大倍数取决于细胞密度。在不同的视野下细胞计数3次。

注意：在细胞计数时，请选择膜中央的视野和膜边缘的视野以精确的代表膜上的细胞数量。侵袭百分比可以表示为通过康宁基底膜基质和膜的细胞迁移与通过未包被膜的细胞迁移的比值。

确定侵袭百分比

侵袭百分比=通过康宁基底膜基质渗透性支持膜侵袭的细胞平均数/通过未包被渗透性支持膜迁移的细胞的平均数

参考文献

1. Mierke, C.T., J. Biophys. 2008:183516 (2008).

Shiah, S.G., et al., Mol. Pharmacol. 64:1076 (2003).

Tran, T,-A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 379:304 (2009). 4. Belov, L., et al., Int. J. Mol. Sci. 12:78 (2011).

5. Moss, N.M., et al., J. Biol. Chem. 284:19791 (2009).

6. Alexander, C.M. and Werb, Z., J. Cell Biol. 118:727 (1992). 7. Korff, T., et al., Exp. Cell Res. 297:415 (2004).

Purushothaman, A., et al., Blood. 115:2449 (2010).

Chu, Y-W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4261 (1993).

Albini, A., and Benelli, R., Nat. Protoc. 2:504 (2007).